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2025-09-22 65

　　以下是 Transgenomics(IDT) 突變檢測試劑盒的正確操作規程：

　　1.前期準備

　　-樣本采集與處理

　　根據實驗需求選擇合適的樣本類型，如血液、組織等。按照說明書要求對樣本進行預處理，包括裂解細胞、提取核酸等步驟，以獲得高質量的 DNA 用于后續實驗。確保提取過程中避免引入雜質和抑制劑，以免影響后續反應的準確性。

　　-儀器校準與檢查

　　確保所使用的儀器設備處于正常工作狀態。提前預熱 PCR 儀至適宜溫度，并檢查其程序設置是否符合試劑盒的要求。同時，準備好干凈的微量移液器及配套槍頭，保證移液精度。

　　-試劑解凍與混勻

　　從 -20℃取出試劑盒后，讓其緩慢升溫至室溫。輕輕顛倒幾次使各組分充分混合均勻，但不要劇烈震蕩，防止產生氣泡或破壞酶活性。特別注意含有酶類的試劑，應在冰上操作以保持其穩定性。

　　-配制反應體系

　　嚴格按照試劑盒說明書的比例取適量的主混合物，其中已包含除模板 DNA 外的所有必要成分。然后加入經純化的模板 DNA，加無菌水補足至總體積到規定值。使用微量移液器準確吸取各組分，每更換一種試劑最好更換一次槍頭，避免交叉污染。

　　-加樣與離心

　　將配制好的反應液小心地加入到 PCR 管或板中。加樣完成后，輕輕混勻樣品并短暫離心，使液體集中于管底，確保反應體系中各成分分布均勻。

　　-設置 PCR 程序

　　根據目標基因序列的長度和 GC 含量等因素，參照試劑盒說明書建議設置熱循環儀的參數，包括變性溫度、退火溫度及延伸時間等。例如，一般變性溫度可設為 94 - 95℃，退火溫度根據引物的 Tm 值確定，通常低于引物 Tm 值 5℃左右，延伸時間則依據片段長度調整。啟動 PCR 儀開始擴增反應。

　　3.酶切分析階段

　　-準備酶切反應體系

　　PCR 擴增完成后，取一定量的擴增產物進行酶切反應。按照試劑盒提供的說明，加入適量的 SURVEYOR 酶和其他必要的緩沖液組件，構建酶切反應體系。注意控制好反應體系的體積和各成分的比例。

　　-孵育與消化

　　將配好的酶切反應體系在合適的溫度下孵育一定時間，讓 SURVEYOR 酶充分發揮作用，切割異源雙鏈 DNA 錯配位點。孵育過程中保持恒溫環境，避免溫度波動影響酶活性。

　　-終止反應

　　到達預定的孵育時間后，采取適當的方法終止酶切反應，如加熱失活酶或者加入終止緩沖液。這樣可以防止過度消化導致結果不準確。

　　4.Transgenomics(IDT) 突變檢測試劑盒結果檢測與分析

　　-選擇合適的檢測平臺

　　該試劑盒支持多種檢測平臺，如標準膠電泳、熒光毛細電泳、LI - COR 等。可根據實驗室現有設備條件選擇合適的平臺進行檢測。如果使用凝膠電泳，需制備合適濃度的瓊脂糖凝膠；若采用熒光檢測系統，則要確保儀器的性能良好且參數設置正確。

　　-上樣與檢測

　　將酶切產物小心地上樣到選定的檢測平臺上。對于凝膠電泳，要注意上樣量適中，避免過載影響條帶分辨率；在使用熒光檢測時，要保證樣品加載正確且無氣泡產生。然后運行檢測程序，獲取數據。

　　-數據分析與解讀

　　根據檢測結果進行分析。觀察切割片段大小能夠提示突變位點的位置，切割產物的數量能夠提示突變數是 1 個、2 個還是 3 個等。結合實驗目的和預期結果，判斷是否存在突變以及突變的類型和位置。同時，注意排除假陽性和假陰性結果的可能性，可通過重復實驗或其他驗證方法來確認結果的可靠性。